CRISPR/Cas9技术与基因治疗

CRISPR/Cas技术是基于原核生物抵御外来病毒及质粒DNA的一种适应性免疫系统开发而来的因编辑技术。通过人工设计的sgRNA（single guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导Cas蛋白酶进行有效切割DNA双链最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。

CRISPR/Cas技术广泛应用于体外分子诊断、基因标记、单碱基编辑等领域。本文讨论了CRISPR技术的发展，以及运用CRISPR/Cas9技术进行基因治疗的实例，并总结了已经获批的CRISPR/Cas9基因治疗方案。

CRISPR技术的发展历程

图1 CRISPR技术的发展历程

1987年，学者首次在大肠杆菌中发现了CRISPR（clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats）序列。2012年，美国学者George Church等人利用CRISPR-Cas9技术成功编辑了人类细胞。此后，CRISPR技术发展迅速，CRISPR/Cas系统的各种变体和应用也不断涌现，如碱基编辑器、dCas9、CRISPRi、CRISPRa、Prime editing等。碱基编辑器是CRISPR/Cas9基因编辑技术的一个重大发展和突破。大约2/3人类遗传病的发生是由于单核苷酸变异导致的，因此，开发一种精准且高效实现单碱基替换的技术尤为重要。David Liu实验室开发的碱基编辑器就此应运而生。David Liu实验室分别将nCas9与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶组成融合蛋白，构成胞嘧啶碱基编辑器(CBE)或腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。此外，将nCas9(H840A)与逆转录酶融合，构成先导编辑器(Prime Editor)，可有效实现所有12种碱基转换。这些碱基编辑器在工作时不依赖DSB的产生，也不需要供体DNA的参与，且在应用实践中不断迭代升级。

自2016年以来，基于CRISPR的基因编辑技术相继应用于临床治疗并取得了巨大成功。

CRISPR-Cas9技术的原理

图2 CRISPR-Cas9技术的原理

图源 维基百科

CRISPR-Cas9技术包含两种重要的组分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的gRNA（guide RNA）。CRISPR-Cas9技术利用一段与靶序列互补的gRNA引导Cas9核酸酶对特异靶向DNA进行识别和切割，造成DNA的双链或单链断裂，然后，细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复，即非同源性末端接合（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源介导的修复（Homology-directed repair, HDR）。

●NHEJ是通过DNA连接酶将双链断裂（DSBs）末端直接连接的一种修复过程，不依赖于同源DNA序列。这种连接过程迅速且高效，但是会随机造成一些序列的缺失或插入，导致无法精准编辑。

●HDR使用相似的DNA序列，通过结合外源性DNA作为修复模板的修复模式。虽然同源介导的修复速度较慢，效率较低，但是修复结果更加精确。

利用两种修复机制，可以实现基因的插入和敲除。比如没有模板的情况下，利用NHEJ修复，随机插入或缺失序列造成基因敲除。有模板存在的情况下，可通过HDR修复在剪切位点引入目的修饰基因，实现基因的定点修改。

体外或体内CRISPR筛选流程

图3 体外或体内CRISPR筛选流程

首先，两种筛选方式都要设计并合成sgRNA：根据需要筛选的基因序列，设计与目标序列匹配的sgRNA。

●体外筛选需要转染细胞：将合成好的sgRNA和Cas9蛋白复合体一起转染进目标细胞，再通过细胞生长特性、荧光标记等方法筛选出目标基因的敲除或编辑细胞，筛选出的细胞进行鉴定和功能验证。

●体内筛选需要构建载体：将sgRNA和Cas9蛋白复合体插入载体中，并将构建好的载体注入到小鼠体内，观察小鼠表型变化并进行筛选和鉴定。

PDX（Patient derived xenografts）动物模型是指将肿瘤组织以组织的形势移植到NOG小鼠体内，从而更好的保持肿瘤的异质性，没有经过人工培养，使得肿瘤组织生物学特性保持的更加完整，从而与临床相似性更高，为研究肿瘤的机制，治疗和药物筛选提供一个理想的模型，是现阶段最优秀的肿瘤动物模型。明迅生物拥有NOG小鼠等人源化免疫重建模型，可根据客户需要定制。                   

用于CRISPR系统体内递送的多种类型的载体

图4 用于CRISPR系统体内递送的多种类型的载体

CRISPR系统在体内传递的三个主要阶段：

（1）载体必须在血液中保持稳定而不会降解或免疫清除；

（2）载体随后在候选组织中积累并触发细胞内吞作用；

（3）CRISPR系统逃逸溶酶体进入细胞核以进行基因组编辑或调节基因表达。

特别是在递送的第二阶段，靶组织中的富集对于成功递送至关重要。实现这一复杂过程需要上图所示运载工具的帮助。

中心区域显示了三种形式的CRISPR作用：pDNA（质粒DNA编码Cas9和sgRNA），mRNA（mRNA编码Cas9）和RNP（Cas9蛋白和体外合成的sgRNA混合物）。中间的圆圈部分显示了转运因子的示例，最外层区域显示了转运因子的生产方式或组件。SU表面包膜蛋白，TM跨膜包膜蛋白。

表1 CRISPR/dCas9系统的各种载体的特性

CRISPR疾病治疗的临床应用

FDA批准的可用于临床治疗的CRISPR疗法。

文本包括FDA批准的日期，疗法的名称以及适应症。

DMD 杜氏肌营养不良症；SCD 镰状细胞病；

TDT 输血依赖性β地中海贫血；

LCA10 Leber 先天性黑朦 10 型；

TTR 甲状腺素转运蛋白。

参考文献：

1. Wang SW, Gao C, Zheng YM, Yi L, Lu JC, Huang XY, Cai JB, Zhang PF, Cui YH, Ke AW. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 2022 Feb 21;21(1):57. doi: 10.1186/s12943-022-01518-8. PMID: 35189910; PMCID: PMC8862238.

2. Li T, Yang Y, Qi H, Cui W, Zhang L, Fu X, He X, Liu M, Li PF, Yu T. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduct Target Ther. 2023 Jan 16;8(1):36. doi: 10.1038/s41392-023-01309-7. PMID: 36646687; PMCID: PMC9841506.