引物设计原则

 

引物长度通常为 18 - 25bp，GC 含量宜在 40% - 60%，且上下游引物 GC 含量尽量接近。引物 Tm 值应在 55 - 65℃，且上下游引物 Tm 值相差不超过 5℃，最好不超过 3℃。

 

1、特异性原则

 

1）序列特异性：引物序列需与目标基因高度互补，可通过 BLAST 等工具在小鼠基因组数据库中比对验证，确保引物只与目标基因匹配。

 

2）3'端特异性：3'端的碱基最好避免出现多个连续的G或C，特别是在最后5个碱基内不应有多于2个的G或C，尽量避免选择A，最好选择T，因为末位为A时，即使在错配的情况下，也能引发链合成。

 

2、扩增效率原则

 

1）产物长度：扩增产物长度一般控制在 100-300bp。

 

2）避免二级结构 ：引物自身及引物对之间应避免形成二级结构，如发夹结构、二聚体等。

 

3、引物位置选择原则

 

1）跨外显子 - 内含子边界 ：将引物设计在基因的外显子区域，且跨越外显子 - 内含子边界。

 

2）避免重复序列和高变异区域 ：避开基因中的重复序列和高变异区域，这些区域可能导致引物特异性差或扩增效率不稳定。

 

使用NCBI设计步骤

 

1）在检索栏中选择“Gene”数据库，输入基因名称，选择物种-小鼠，点击搜索。

 

 

 

2）在界面中下拉找到mRNA and protein，点击NM开头的一串代号。
 

 

3）点击pick primers, 限制产物长度在80-150最佳，可根据结果适当放宽，Tm60℃，核对物种正确，点击get primer。
 

 

 

4）获得结果 ，一般会出现多个相关信息，根据引物设计原则选择合适的引物。
 

 

5）在BLAST中验证特异性。首页点击BLAST，下拉点击primer-BLAST。
 

 

6）将获得的引物序列根据F和R输入到相应的框内，其他参数不用调节，点击get primers。
 

 

 

结果如下：
 

 

 

参考资料：

[1]https://zhuanlan.zhihu.com/p/366420710

[2]https://mp.weixin.qq.com/s/hiCbzfGI3i4ZRAm8goiYOw

[3]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

 

特别声明：本文来自明迅生物公众号，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在公众号后台留言联系我们。其他合作需求，请联系sales@mingceler.com。

 

免责声明：部分素材源于网络，如有侵权，联系删除，本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表明迅生物立场，亦不代表明迅生物支持或反对文中观点。