小鼠精子冻存
 

在基因工程小鼠的长期保种和育种工作中，与之传统的活体保种相比，通过冷冻保存精子方法进行小鼠的保种、育种，不仅可以显著节省饲养成本，而且能够确保遗传特性的稳定性，有效预防群体内的遗传漂变和遗传污染。  定义及原理  

 

 

精子冷冻，又称为精子冷保存，是一种将精子置于冷冻保护剂中，通过超低温冷冻使水分子保持无序形态，形成玻璃样超微粒结晶，从而有效避免精子细胞内结晶的形成及其对细胞结构的破坏。
 

原理即通过低温处理的方式，使精子的新陈代谢活动被降低或抑制，从而延长其保存寿命。经过复苏后，精子仍然具有一定的活力和受精能力。
 

与胚胎冷冻保存相比，精子的冷冻保存需要较少供体小鼠，其方法也更加快捷简便。

发展历程  
 

1776年意大利科学家Lazaro Spallanzani首次发现，将精液冷冻后仍能恢复部分精子活力。
 

1949年Polge等人发现了甘油这种具有防冻性能的物质，精子冻存技术真正进入科学视野。
 

1990年小鼠精子冷冻保存技术取得突破，Takeshima, Nakagata and Ogawa发表相关文章，成功率高、重复性强的小鼠精子冷冻方法是在水中添加3%的脱脂乳和18%的棉子糖作为冷冻保护剂。
 

优点及选择因素

 

1）节省长期成本并节省小鼠饲养空间，能够保留非常大量的种质；
2）避免在面临意外事故或自然灾害时重要品系的损失；
3）对于易受转基因不稳定影响的转基因品系，有助于维持品系的稳定；

4）有助于控制遗传漂变，防止表型的自发丢失。
 

精子的低温保存是一项经济上合算的保种措施，但选择冷冻保存精子一般还要基于下列因素：

① 保存纯合突变基因型或特殊背景基因型的必要性；

② 精子和胚胎冷冻后的活力比较； 

③ 获得足够冷冻胚胎数目的能力和繁殖力； 

④ 小鼠品系精子对低温保存的耐受性（Sztein等，2000a）； 

⑤ 基因型不同的胚胎活力的差异（Schmidt等，1985，1987）。 

操作步骤  

 

1、过滤1M的DMSO溶液同时在培养皿中注入四个1M的DMSO液滴（100μL/液滴），其中一个液滴用于清洗收集液中的胚胎，其他的液滴则用于放置清洗后的胚胎。

 

2、将收集液中的一组胚胎移入其中的一个液滴内，然后将清洗后的胚胎均匀分配至另外三个液滴中，这些胚胎最终将被转移到冷冻管内。
 

3、取一20μL的移液器及凝胶枪头，调整移液量至5μL后吸取所有胚胎，移入冷冻管内，然后将冷冻管放入台式冷却器内在0℃状态平衡5分钟。
 

 

图源：小鼠生殖工程技术
 

注意:1）尽可能将冷冻管放在0°C冷却器内可超过5分钟(<20分钟).2）吸取胚胎前，先将培养皿旋转几下使胚胎集中在液滴中央，以便于吸入5uL的1M的DMSO溶液中包含所有胚胎。

4、加入预先放置在0℃冷却器内平衡的抗冷冻液（DAP213）45μL，再平衡5分钟。

5、迅速将冷冻管卡入固定夹后直接浸入液氮中。